Евсюков Игорь Валерьевич

Квалификационная работа магистра: "Поиск генов, участвующих в метастазировании CEA-продуцирующих клеток колоректального рака, методом РНК-секвенирования"

Аннотация: Онкомаркеры играют важную роль в выявлении злокачественных заболеваний человека. Повышенное содержание раково-эмбриональный антигена (РЭА, CЕА CЕАСАМ5) в сыворотке крови пациентов после удаления первичной опухоли используется в онкологической практике в качестве маркера наличия метастазов.
Целью настоящего исследования является проведение сравнительного анализа транскриптомов клеточных линий колоректального рака с различной продукцией СЕА и метастатической активностью для идентификации генов, вовлеченных в ответ на СЕА.
Был проведен сравнительный анализ результатов РНК-секвенирования библиотек комплементарной ДНК, полученных из клеточных линий колоректального рака: MIP101 и MIP101-clone 8. В CEA-продуцирующих клетках выявлено изменение уровня экспрессии 216 генов.
Для дальнейшего анализа были выбраны 4 гена (DSP, EZR, PCDH1, WFS1) с повышенной экспрессией и 3 гена (GADD45A, KLF11, PPP1R15A) с пониженной экспрессией в CEA-продуцирующих клетках. Результаты, полученные с использованием методов биоинформатики были подтверждены методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией.
Анализ функций выявленных генов позволяет предположить, что изменение их экспрессии может способствовать эпителиально-мезенхимальному переходу, увеличению инвазивности опухолевых клеток в окружающие ткани, повышению выживаемости циркулирующих раковых клеток и, как следствие,  процессу метастазирования.
Дальнейшее исследование белковых продуктов выявленных генов позволит определить их терапевтическую ценность в качестве онкомаркеров и мишеней для лечения больных с метастазами.

Направление: Биология

Кафедра: Генетики и Биотехнологии

Научный руководитель: к.б.н.  Баженова О.В.

Отзыв научного руководителя
Я впервые познакомилась с Игорем Валерьевичем Евсюковым на дне открытых дверей кафедры Генетики и биотехнологии в 2010 году. В то время он был студентом первого курса, интересующимся генетикой человека. В 2013 году мне посчастливилось быть рецензентом его работы бакалавра: "Освоение и оптимизация методов оценки метилирования промоторных областей генов, ассоциированных с патологиями беременности".  Затем Игорь с отличием защитил степень бакалавра и поступил в магистратуру. За 2 года магистратуры на кафедры Генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского университета Игорь проявил себя как очень трудолюбивый, энергичный, приятный в общении и любознательный студент. В настоящее время он написал свою магистерскую диссертацию на тему: “Поиск генов, участвующих в метастазировании CEA-продуцирующих клеток колоректального рака, методом РНК-секвенирования." За время магистратуры в дополнение к молекулярно-биологическим методам он освоил новые для него методы биоинформатики, совершенствовался в знании английского языка и принимал активное участие в жизни университета.  Игорь Валерьевич Евсюков дважды, в 2013 и 2014 годах, стал Победителем международных Универсиад МГУ по биологии в Москве, получив награды Правительства Москвы и Комитета по Науке и Высшей школе. Игорь продемонстрировал свою способность работать самостоятельно, освоив не простые методы анализа транскриптома, ПЦР в реальном времени и культивирования клеток млекопитающих. Он интересуется научной литературой и современными методы исследования, чтобы расширить свои научные навыки и отлично знает английский язык. Без сомнения, Игорь Валерьевич Евсюков заслуживает степени магистра биологических наук. Я желаю ему больших успехов в его дальнейшей научной карьере и жизни.

Рецензент:   Иголкина Анна Андреевна

Рецензия 

Магистерская диссертация И.В. Евсюкова  посвящена поиску генов ассоциированных с метастазированием CEA-продуцирующих клеток колоректального рака на основании анализа данных, полученных с помощью технологии РНК-секвенирование.
На сегодняшний день по статистике WHO (World  Health  Organization, 2012) раковые заболевания занимают 15% от всех причин смертей населения на планете, при этом метастатическая форма рака была обнаружена в 90% летальных случаев. Точным клиническим маркером образования метастаз является повышенная концентрация раково-эмбрионального антигена (РЭА или СЕА) в сыворотке крови пациентов. Поскольку изменение уровня экспрессии CEA  невозможен в клетках без изменения уровней экспрессии других генов, в работе была поставлена задача провести анализ  транскриптомных данных в раковых клеточных линиях, продуцирующих и не продуцирующих CEA. В работе было проведено сравнение модельной линии клеток колоректального рака MIP101 и его CEA-продуцирующей  линии MIP101-clone8 с высоким метастатическим потенциалом. Анализ дифференциальной экспрессии между двумя клеточными линиями был проведен всего лишь для четырех образцов (две повторности для каждой линии), поэтому перед соискателем стояла также задача подтвердить или опровергнуть выявленную дифференциальную экспрессию.
В работе автором было поставлено не две, а три задачи, две из которых идеологически совпадают между собой, и кроме того одна из них практически дублируется как цель исследования.
В работе предложен ряд современных технологий определения уровней экспрессии генов в образцах и приведен их сравнительный анализ. Обсуждены различные способы картирования транскриптомных данных на геном, приведены программные пакеты, осуществляющие подсчет уровней экспрессии альтернативных форм гена, а так же биоинформатические  пакеты программ для оценки дифференциальной экспрессии генов. Некоторые из них были применены для анализа транскриптомных данных четырех  образцов  некорректно. Например, И.В. Евсюков использовал пакет Cufflinks для определения уровней экспрессии генов в виде FPKM, однако анализировал дифференциальную экспрессию с помощью пакета edgeR, который не допускает использования FPKM уровней на вход. При этом соискатель отказался от метода Cuffdiff, который работает с FPKM, аргументируя тем, что Cuffdiff не дает конкретизация значений p.value ниже 10^-5. Кроме неправильного использования метода определения дифференциальной экспрессии, автор работы показал непонимание смысла p.value, так как использовал в работе уровень значимости 0.01.
В ходе работы автор часто оперирует субъективными характеристиками, не подкрепленными сравнением  количественных величин. А именно на стр. 22 автор пишет следующее: “Она очень быстрая, требует мало оперативной памяти и особенно эффективно выравнивает прочтения длиной от 50 до 100 нуклеотидов на большой геном (например, геном человека)”. … “ Вдобавок также как и Bowtie, TopHat не требует много оперативной памяти (Trapnell et al. 2009)”. Из представленных фраз не ясна обоснованность таких суждений как: «очень быстрая», «мало оперативной памяти», «особенно эффективно», «большой геном», «много оперативной памяти». К подобным неточностям в настоящей работе можно отнести словосочетание «гигантскую таблицу» (стр. 25) и фразу: «Под значащими изоформами подразумеваются те изоформы, чей профиль экспрессии вносит существенный вклад профиль экспрессии соответствующего гена» (стр. 36) - для которой не объяснено, как была рассчитана существенность вклада.
Результаты работы подкреплены большим количеством иллюстрирующего материала в тексте работы и в приложении. Однако часть из них имеет неполноту обозначений. Например, Рис.10 и четыре из семи рисунков приложения представляют собой графики кривых амплификации генов, на которых количество обозначений меньше количества представленных кривых. Кроме этого,  результаты  Рис. 7, на котором отмечены уровни экспрессии генов для каждого образца в виде «boxplot», нуждаются в пояснении. Автор должен объяснить, каким образом он оценил  вариабельность экспрессии генов в каждом образце, если каждый образец был просеквенировал всего лишь один раз?
Название работы полностью соответствует ее содержанию, соискатель  показал свою эрудированность в обзоре литературы и подкрепил изложенный материал ссылками на 104 источника литературы, кроме того в разделе обсуждение подчеркнута важность данной работы в контексте исследования взаимодействия CEA c СЕАR (рецептор раково-эмбрионального антигена). Однако оглавление работы не соответствует структуре работы,  некоторые ссылки на рисунки не подкрепляют изложенный материал (стр. 24, ссылка на Рис.4; нет ни одной ссылки на Рис.2). Кроме того, в работе встречаются отдельные смысловые неточности формулировок (например, на стр. 17: «секвенатор считает число ридов (RPKM)»; стр. 22: «Суть сборки транскриптома сводится к восстановлению наибольшего числа транскриптов из имеющихся данных секвенирования»), не снижающие, однако, общего хорошего уровня исследования.
Научная и практическая значимость работы состоят в определении генетических маркеров, ассоциированных с метастазированием раковых клеток, что расширяет понимание процессов, вовлеченных в метастазирование на молекулярном уровне, а также дает направление для разработки эффективных методов профилактики и лечения метастазов.
Заключение: работа И.В. Евсюкова отвечает всем требованиям, предъявляемым ГАК, и на основании таблицы критериев оценки заслуживает оценки «хорошо», а соискатель   присвоения степени магистра.
                         

Дата защиты: 17-06-2015