АБИТУРИЕНТУ   СТУДЕНТУ   ВЫПУСКНИКУ   СОТРУДНИКУ   РАСПИСАНИЯ


БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

ГЛАВНАЯ
НАШ ФАКУЛЬТЕТ
ПОСТУПЛЕНИЕ
ПЕРЕВОД И ВОССТАНОВЛЕНИЕ
ОБРАЗОВАНИЕ
Учебно-методическая комиссия
Бакалавриат
Магистратура
Аннотации элективных дисциплин
Аспирантура
Докторантура
Выпускникам 2017
Конкурсы и стипендии
Соц. пакет студента
Вопросы по справкам и документам
НАУКА
ЭТИЧЕСКИЙ КОМИТЕТ
ШКОЛЬНИКАМ И УЧИТЕЛЯМ
СТУДСОВЕТ
БИБЛИОТЕКА
ЭКСПЕРТНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ
САЧОК
БЛОГ
ТРУДОУСТРОЙСТВО
АДМИНИСТРАЦИЯ
СВЕДЕНИЯ О СПбГУ
ЗЕЛЕНЫЙ КАМПУС

Авторизация
Запомнить меня на этом компьютере
  Забыли свой пароль?
 

Главная / Образование / Магистратура

Магистерские дипломы




Кочеткова Елена Юрьевна

Квалификационная работа магистра: "Изучение роли и регуляции mTOR-сигнального каскада в HDACI-индуцированном клеточном старении и аутофагии"

Аннотация: Целью данной работы является выявление роли MEK/ERK-ветви Ras/Raf/MEK/ERK-каскада в регуляции активности комплекса mTORС1 – ключевого координатора процесса клеточного старения, индуцированного в трансформированных клетках действием ингибитора гистоновых деацетилаз - (HDACI) бутиратом натрия. Клеточное старение рассматривается как тумор-супрессорная программа, необратимо блокирующая пролиферацию опухолевых клеток. Несмотря на то, что в злокачественных клетках эта программа обычно подавлена, ее можно реактивировать при помощи цитостатиков, ретиноидов и ингибиторов HDAC. Однако, несмотря на ингибирование пролиферации, стареющие опухолевые клетки сохраняют жизнеспособность и секретируют ряд факторов, которые могут вовлекать в процесс трансформации окружающие клетки. В связи с этим поиск путей элиминации стареющих опухолевых клеток является необходимым условием успеха противоопухолевой терапии. Для решения этого вопроса были поставлены задачи: оценить влияние ингибитора MEK/ERK на способность трансформированных клеток реализовать программу HDACI- индуцированного старения и оценить роль киназ MEK/ERK в регуляции активности каскада mTOR – одного из интегральных координаторов процесса клеточного старения и аутофагии. Работа выполнена на эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных онкогенами E1A+cHa-Ras. Старение клеток индуцировали с помощью ингибитора HDAC бутирата натрия (NaBut), а роль MEK/ERK изучали с помощью специфического ингибитора MEK-киназ PD0325901 (PD). Для оценки развития процесса старения при действии NaBut в условиях ингибирования MEK/ERK-ветви анализировали маркеры клеточного старения: необратимый блок клеточного цикла и подавление пролиферации, развитие гипертрофного фенотипа, ассоциированную со старением β-галактозидазу и активацию комплекса mTORC1. Обнаружено, что процесс NaBut-индуцированного старения при ингибировании MEK/ERK сопровождается блоком клеточного цикла, подавлением пролиферации, а также повышением SA-β-галактозидазной активности, ассоциированной со старением. Подавление пролиферации становилось необратимым уже через трое суток, в отличие от старения, когда MEK-ERK была активной, а старение было необратимым после пяти суток. Индукция старения в условиях ингибированной MEK-ERK активности резко снижала жизнеспособность клеток. Ингибирование MEK/ERK не предотвращает активацию комплекса mTORC1, вызванную действием NaBut. Более того, ингибирование MEK/ERK приводит к заметной активация комплекса mTORC2, сопровождающейся реорганизацией актинового цитоскелета клеток с образованием мощных стресс-фибрилл. Несмотря на активацию mTORC1 – регулятора синтеза белка, в условиях ингибированной MEK/ERK активности в стареющих клетках не наблюдалось накопления белка, что, может быть, связано с активацией процесса mTOR-независимой аутофагии и/или вовлечением в эти процессы системы протеасомной деградации. Индукция старения при ингибировании MEK/ERK-активности MAP-киназного каскада вызывает не только более эффективное подавление пролиферации стареющих клеток, но и снижение их жизнеспособности, что представляет интерес в перспективе разработки новых стратегий терапии Ras-экспрессирующих опухолевых клеток.

Направление: Биология

Кафедра: Цитологии и Гистологии

Научный руководитель: к.б.н. Поспелова Татьяна Викторовна

Дата защиты: 10-06-2014

Отзыв о магистранте:

Текст (.pdf)

Рецензент: Спивак И.М.

Рецензия: Работа, представленная Еленой Юрьевной Кочетковой, посвящена актуальной теме активации программы старения в трансформированных клетках с возможной индукцией их последующей гибели.. Старение – это одна из естественных тумор-супрессорных программ, которая может быть использована для терапии онкологических заболеваний, например, при устойчивости опухолевых клеток к апоптозу. В тоже время «старые» клетки имеют специфический секреторный фенотип, способствующий малигнизации находящихся рядом «молодых» клеток. «Старые клетки - хорошие жильцы, плохие соседи» - так звучит название одной из статей Джудит Кампизи в журнале «Cell». Таким образом, и в медицине и в экспериментальной онкологии в настоящее время сложилась ситуация, при которой настоятельно востребованы новые подходы, позволяющие использовать сигнальные системы самой клетки в терапевтических целях и влиять на возможный выбор той или иной программы остановки клеточной пролиферации и последующей деградации. Исследование Е.Ю.Кочетковой является частью большой многолетней работы, которая ведется в лаборатории Валерия Анатольевича и Татьяны Викторовны Поспеловых в институте цитологии РАН. В исследовании действия двух различных ингибиторов - ингибитора гистоновых деацетилаз бутирата натрия и ингибитора МЕС1,2 киназ PD0325901 (PD), то есть MEK/ERK-ступени Ras/Raf/MEK/ERK сигнального каскада, использованы ранее полученные в лаборатории линии эмбриональных клеток грызунов, трансформированные онкогенами E1A+cHa-Ras. Здесь важно помнить, что киназы MEK, фосфорилируют тирозин и треонин киназ ERK1, 2 и не имеют других мишеней. Ингибиторы гистоновых деацетилаз способны индуцировать в трансформированных клетках блоки пролиферации клеточного цикла, то есть процесс, подобный старению в нормальных клетках. Несмотря на то, что ингибиторы гистоновых деацетилаз уже активно используются в сочетанной терапии опухолей, механизмы индуцируемого ими блока пролиферации трансформированных клеток и их возможной последующей гибели очень сложны и неясны. В настоящее время горячей точкой изучения процессов старения является TOR–киназа, и сформированные на ее основе комплексы TORC1 и TORC2. TOR млекопитающих (mTOR) контролирует рост клеточной массы и метаболизм в ответ на изменение количества питательных веществ (например, аминокислот), факторов роста (например, инсулина, IGF-1, PDGF) и энергетического состояния клеток (АТФ). TOR активирует увеличение размеров клеток за счет положительной и отрицательной регуляции нескольких анаболических и катаболических процессов, соответственно, которые совместно определяют накопление клеточной массы. Работа Е.Ю.Кочетковой предлагает новый подход для выяснения контроля молекулярных механизмов сочетанного действия ингибиторов гистоновых деацетилаз и ингибитора MEK1,2 -киназ PD0325901. Диссертационная магистерская работа Е.Ю.Кочетковой построена традиционно и состоит из обычных разделов. Она существенно превышает по своему объему и сложности поставленных вопросов обычное магистерское исследование. «Обзор литературы» написан очень подробно, вполне грамотно. В нем в основном использованы публикации последних семи лет, и автор показывает высокую степень умения работать с литературой. Подробное описание сигнальных путей регуляции киназы mTOR и аутофагии, анализ ведущих белков, вовлеченных в эти процессы, является непростой задачей. Особенно интересным и важным представляется подробный разбор литературы, посвященной аутофагии – процессу, роль которого в жизни клетки и организма в целом сейчас активно дискутируется. Одна группа данных позволяет предположить, что в стареющих клетках и некоторых типах солидных опухолей аутофагия способствует изоляции избыточного, активно синтезирующегося белка, играя, таким образом, протекторную роль. В тоже время именно аутофагия может приводить к гибели постаревших клеток и есть работы, свидетельствующие, что аутофагия необходима для развития самой программы старения, а не только является следствием ее следствием. По тексту обзора видно, что писала его Е.Ю.Кочеткова совершенно самостоятельно. Иногда встречаются жаргонные слова и выражеения, например Елена Юрьевна часто пишет «на мышах показано, что….» (стр. 21,23), что выглядит несколько неудачно при письменной речи. Гораздо лучше и проще «у мышей показано…» ; «Стареющие клетки развивают определенную морфологию» (стр. 12); «белок p21 является мишенью опухолевого супрессора p53» (стр. 8) - разумеется, транскрипционной мишенью белка Р53 является ген р21. Кроме того, есть несколько неясных мест, например на стр. 10 читаем «Если в нормальных клетках в аэробных условиях глюкоза сначала преобразуется путем гликолиза в пируват, который в митохондриях перерабатывается до СО2, а в анаэробных условиях равновесие сдвигается в сторону гликолиза, вследствие чего поступление пирувата в митохондрии снижается, то в случае раковых клеток даже в аэробных условиях преобладает гликолиз («аэробный гликолиз»)» (стр.12) или «Кроме того, Ras/Raf/MEK/ERK-каскад способствует активации комплекса mTORC1 (Steelman et al., 2011), и активности MAPK-каскада и PI3K-сигнального пути динамически связаны. Ras/Raf/MEK/ERK-сигнальный каскад является эссенциальным для организма, и представляет интерес как мишень для терапии» (стр. 22). К тому же почему-то не повезло ГДФ и ГТФ, которые в отличие от всего остального обозначаются русскими аббревиатурами «GEF mSOS осуществляет преобразование неактивного Ras-ГДФ в активный Ras-ГТФ, который после передачи сигнала преобразуется в неактивную ГДФ-связанную форму за счет активности GAP; это классический путь функционирования малых ГТФаз» (стр. 21). Мне кажется, что гораздо цместнее было бы обозначить их в данном контексте как GTP и GDP. В тоже время эти погрешности (которых меньше, чем было в бакалаврской работе) свидетельствуют о том, что Елена Юрьевна самостоятельно провела серьезное осмысление очень сложного и противоречивого материала, который она старалась описать максимально корректно. Все эти погрешности могут быть легко устранены небольшой редакторской правкой. Работа выполнена на высоком методическом уровне, Е.Ю.Кочеткова построила свое исследование на целом ряде сложных современных методов. Ею освоены технологии работы с клеточными культурами, а также такие молекулярно-биологические и клеточные методы как метод проточной цитофлуориметриии, приготовление клеточных препаратов и различные способы их окрашивания, включая методы непрямой иммунофлуоресценции. Очень важнм является метод иммуноблоттинга, позволяющий количественно сравнить исследуемые Е.Ю.Кочетковой белки-мишени комплексов TORC1 и TORC2. Подробное описание методов дано в разделе "Материалы и методы", написанном, очень грамотно, логично и вдумчиво. К сожалению, в описании методов тоже вкрались погрешности. Например, неоднократно написано, что клетки снимали с ростовой поверхности «раствором трипсина в версене». Раствор Версена назван по имени ученого, который ввел его в «культуральный» обиход. Это просто раствор ЭДТА. Так что - или смесь раствора трипсина с раствором Версена, или трипсин в растворе ЭДТА. Антитела для непрямого анализа все-таки принято называть первыми и вторыми, а не первичными и вторичными, белок измеряют по методу Брэдфорда а не Брэдфорд (он мужчина). Раздел «Результаты» написан подробно, одновременно содержит в себе элементы обсуждения и описание логики проведения экспериментов. Такая подача материала представляется крайне удачной именно для данного исследования, так как позволяет более подробно увидеть, как именно оно проводилось. Описание результатов сделано очень четко и хорошо иллюстрировано. Особенно хочется отметить качество микрофотографий. При исследовании Ras-экспрессирующих опухолевых клеток ранее было показано, что строгая регуляция аутофагии важна для выживания и поддержания гомеостаза этих клеток, а по некоторым данным, аутофагия необходима для Ras-трансформации. Исходя из этого, в работе Е.Ю.Кочетковой крайне интересными представляется исследование возможностей модулирования индуцированного старения именно в Ras-трансформированных клетках, так как совместное действие двух использованных ингибиторов привело не только к развитию необратимого фенотипа клеточного старения, но и к повышенной гибели клеток. Эти результаты позволяют подойти к пониманию того, какие механизмы могут быть вовлечены в процесс элиминации стареющих опухолевых клеток. При этом повышенная гибель клеток, наблюдаемая при совместном действии двух ингибиторов не сопровождается завершенной аутофагией и отсутствие накопления белка в этих клетках вероятно связано с каким-то другим процессом, может быть, протеасомной деградацией. В тоже время, при действии только одного PD0325901 аутофагия проходит полностью. Наблюдающиеся при ингибировании MEK/ERK киназ эффекты могут объясняться возрастающей активностью Ras, который имеет множество мишеней. Сравнение действия бутирата натрия совместно с подавлением активности МЕK1,2-киназ специфическим ингибитором PD0325901 позволяет Е.Ю.Кочетковой сделать вывод, что ингибирование MEK/ERK-ступени само по себе не оказывает такого существенного влияния ни на пролиферативную активность, ни на способность давать клоны в редком посеве: после удаления PD как после трех, так и после пяти суток культивирования клетки восстанавливали способность пролиферировать и давать клоны, даже морфологические изменения, произошедшие при таком ингибировании оказались обратимыми: после удаления PD из среды культивирования клетки за двое суток восстановили морфологические черты, характерные для исходных клеток. При этом вероятно, именно ингибирование MEK/ERK-ступени Ras/Raf/MEK/ERK сигнального каскада приводит к активации TORC2 и серьезному изменению цитоскелета (вероятно, при участии интегринов). Несмотря на то, что регуляция mTORC2 менее изучена, данные Е.Ю.Кочетковой позволяют говорить и о том, что между двумя mTOR-содержащими комплексами есть некоторое количество обратных связей, благодаря которым может осуществляться как позитивная, так и негативная регуляция mTOR-сигналлинга. Очень сильное впечатление производит раздел «Обсуждение». Этот раздел занимает 9 страниц и, по моему мнению, является ключевым для бакалаврской работы Елены Юрьевны Кочетковой. Он хорошо согласуется с «Обзором литературы» и «Результатами», но не повторяет их. Именно в разделе «Обсуждение» Е.Ю.Кочеткова смогла выразить свое понимание возможности активации программы ускоренного старения в E1A/cHa-Ras-трансформантах путем повышения активности TOR-киназы при одновременном подавлении MEK/ERK-ступени Ras/Raf/MEK/ERK сигнального каскада. Магистерская диссертация Елены Юрьевны Кочетковой является самостоятельным законченным научным исследованием. Выводы обоснованы полученными результатами. Список цитируемой литературы содержит 96 наименований, составлен грамотно. Указанные небольшие недостатки ни в коей мере не умаляют того положительного впечатления, которое производит магистерская диссертация Елены Юрьевны Кочетковой. Её работа, выполненная с применением самых современных методов, вносит серьезный вклад в наши представления о роли киназ MEK 1,2 в процессах индуцированного клеточного старения. Данное исследование может служить основой для дальнейшего поиска препаратов, которые при совместном действии с бутиратом натрия приводили бы не только к индуцированному старению опухолевых клеток, но и их последующей гибели. Хочется отметить, что работа Е.Ю. Кочетковой по своему объёму, серьезности поставленных задач и многообразию методов, использованных для их решения вполне может лечь в основу кандидатской диссертации. Диссертационная магистерская работа Елены Юрьевны Кочетковой, безусловно, заслуживает оценки «ОТЛИЧНО», а ее автор - звания магистра биологии. Рекомендовано продолжить образование и научную работу в аспирантуре.

Аннотации квалификационных работ магистров выпуска 2011г.

Аннотации квалификационных работ магистров выпуска 2012г.

Аннотации квалификационных работ магистров выпуска 2013г.

Аннотации квалификационных работ магистров выпуска 2014г.

Аннотации квалификационных работ магистров выпуска 2015г.

Аннотации квалификационных работ магистров выпуска 2016г.


контакты       карта сайта      почтовый сервер       управление      поддержка

199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9
© Санкт-Петербургский государственный университет, 2006-2017