Биологический факультет СПбГУ |
Группа рецепции и трансдукции гормональных и метаболических сигналов |
Наряду с этим считается доказанным, что механизм действия ауксина в инициации роста растяжением заключается в активации Н+-АТФазы плазмалеммы (Hager et al., 1982; Полевой, 1986; Hager, 2003). В связи с этим особое значение приобретает изучение свойств фермента в ходе онтогенеза, в первую очередь в ходе роста растяжением. На модельных объектах: колеоптилях кукурузы и клеточных линиях табака, сохраняющих стадию роста растяжением, проведен анализ гидролитической и транспортной активности фермента. Показано нелинейное изменение интенсивности гидролиза АТФ и транспорта протонов, а также изменение чувствительности Н+-АТФазы плазмалеммы к ванадату и величины Кm фермента. В работе принимали участие Шишова М.Ф., Кирпичникова А.А., Еремина М.А. | ||||||||||||||||
Рис. 6. Модель изменения активности протонных насосов растительной клетки при переходе от деления к растяжению и последующему завершению роста. |
Совместно со ст.н.с. Танкелюн О.В. проведен сравнительный анализ активности тонопластных Н+-АТФазы и пирофосфатазы тонопласта клеток суспензионной культуры табака. Предложена модель изменения активности протонных насосов растительной клетки при переходе от деления к растяжению и последующему завершению роста (Рис. 6). | |||||||||||||||
Выявленное увеличение активности Н+-АТФазы плазмалеммы может быть опосредовано увеличением числа фермента посредством усиления экспрессии кодирующих его генов, а также изменением его свойств в результате пост-трансляционной регуляции. В настоящее время проводится исследование изменения числа ферментативных комплексов на плазмалемме с помощью блот-анализа. В сотрудничестве с группой Лутовой Л.А. (кафедра генетики и селекции СПбГУ) проводится анализ экспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазы и пирофосфатазу в клетках гипокотилей и корней проростков арабидопсиса. Идентификация генов, кодирующих ферменты синтеза, а также белки-транспортеры ауксина у бурой водоросли Fucus vesiculosus Влияние ауксина на рост и развитие водорослей, в целом, соответствует спектру его физиологического действия у высших растений (Тараховская и др., 2007). Ауксин стимулирует ризоидообразование у ряда видов водорослей, подобно тому, как это происходит у мхов (Basu et al., 2002). В клетках Chara globularis (Charophyta) при обработке ауксином происходят такие же изменения цитоскелета, как и у покрытосеменных растений (Jin et al., 2008). В апикальных и интеркалярных зонах таллома красной водоросли Grateloupia dichotoma ауксин стимулирует деление и растяжение клеток и/или подавляет ветвление, что также напоминает процессы, характерные для покрытосеменных (Yokoya et al., 1996). Действием ауксина определяется поляризация зигот фукоидных водорослей, что подтверждается нарушением нормального развития зигот в присутствии ингибиторов полярного транспорта ИУК (Полевой и др., 2003). К сожалению, представления о ферментах, участвующих в синтезе гормонов у водорослей весьма ограничены. Еще более фрагментарны данные о генах, кодирующих ферменты синтеза фитогормонов в этой группе фотоавтотрофов. Современные данные о геномах и протеомах ряда водорослей позволяют выявить последовательности ДНК, предположительно кодирующие ферменты синтеза или аминокислотные последовательности, имеющие гомологию с консервативными доменами соответствующих ферментов. В связи с этим в 2010 г. начались исследования по идентификации генов, кодирующих ферменты синтеза ауксина у бурой водоросли F.vesiculosus, а также генов, кодирующих транспортеры фитогормона. В работе принимают участие Шишова М.Ф., Тараховская Е.Р., Маслов Ю.И., Киселева А.П. Выявление сигнальной функции сахаров и органических кислот в регуляции развития зеленой водоросли Chlamydomonas reinchardtii Скорость размножения микроводорослей связана как с активностью фотоассимиляционного аппарата, так и со способностью метаболизировать экзогенные органические соединения. С изменением скорости роста культуры связаны изменения метаболизма – соотношения направленности процессов ассимиляции и диссимиляции, что определяет характер накопления тех или иных метаболитов (Heyfets et al., 2000; Yang et al., 2000). Однако энергетические и сигнальные механизмы микроводорослей, обеспечивающие переход к миксотрофии, остаются не до конца ясными. К числу мощнейших трофических сигналов можно в первую очередь отнести сахара. Выявление пула сахаров и других органических соединений, а также их перераспределение между цитоплазмой и хлоропластом с помощью жидкостной и газовой хроматографии, сопряженной масс-спектрометрией является необходимым этапом в исследовании данной проблемы. В связи с расшифровкой генома C. reinhardtii становятся возможными исследования на молекулярно-биологическом уровне. В 2010 г. начаты исследования по выявлению изменений метаболического спектра C. reinhardtii дикого типа и с дефектами синтеза пигментов при автотрофных и миксотрофных типах питания. Планируется получить мутанты с дефектами транспортеров сахаров на плазмалемме и хлоропластных мембранах и оценить их роль в регуляции развития водоросли и как сенсоров метаболических сигналов. В работе принимают участие Шишова М.Ф., Шаварда А.Л., Маслов Ю.И., Пузанский Р.К. Работа проводится в сотрудничестве с группой проф. Ермиловой Е.В. (кафедра микробиологии СПбГУ) и ст.н.с. Чекуновой Е.М. (кафедра генетики и селекции). Основные темы исследований, предлагаемые студентам и аспирантам для работы в группе «Физиология стресса и адаптации растений»: • Выяснение внутриклеточной компартментализации Са2+ и протонного трансдукционных каскадов при восприятии ауксинового сигнала. • Анализ экспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазы и пирофосфатазу в клеточных культурах и нативных органах растений в ходе роста растяжением. • Идентификация генов, кодирующих ферменты синтеза ауксина у бурой водоросли Fucus vesiculosus, а также генов, кодирующих транспортеры фитогормона. • Выявление изменений метаболического спектра Chlamydomonas reinhardtii дикого типа и с дефектами синтеза пигментов при автотрофных и миксотрофных типах питания. • Оценка роли транспортеров сахаров на плазмалемме и хлоропластных мембранах C. reinhardtii в регуляции развития водоросли и как сенсоров метаболических сигналов. Исследования ведутся с использованием • спектрофлуориметрических методов оценки концентрации ионов кальция и протона, а также мембранного потенциала, генерируемого на мембранах везикул плазмалеммы; • метода флуоресцентной микроскопии для оценки внутриклеточной концентрации вторичных посредников; • спектрофотометрические методов оценки активности ферментов, в том числе их кинетических свойств (Km); • методов белкового анализа, включая блот-анализ; • методов ПЦР и ПЦР в реальном времени; • газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией. Модельные объекты, используемые в работе: • проростки кукурузы; • проростки арабидопсиса дикого типа, мутанты и трансформанты с измененной чувствительностью к ауксину и нарушенным кодированием протонных транспортеров; • клеточные линии табака VBI-0 и By-2, дикого типа и антисенс-трансформанты по белку ABP1 (NAS-1). • бурая водоросль Fucus vesiculosus • зеленая водоросль Chlamydomonas reinchardtii Сотрудничество с другими организациями: Научные группы кафедр генетики и селекции, а также микробиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ Научные учреждения Санкт-Петербурга (Ботанический институт РАН), России (Институт биохимии и генетики, Институт биологии Уфимского НЦ РАН) и зарубежных стран (университеты Гановера, Стокгольма, Варвика, Хельсинки, Институт экспериментальной ботаники Чешской академии наук). Гранты: Реализация научных проектов неоднократно финансировалась российскими и международными научными фондами, в том числе из средств СПбГУ: РФФИ 98-04-49878-а Исследование динамики эндогенной компетентности растительных клеток к ауксину (1998-1999) Руководитель – Шишова М.Ф. Грант INCO-Copernicus PL №97117 (1998-2004) Руководитель – Полевой В.В. (1998-2001) Руководитель – Шишова М.Ф. c 2001 года РФФИ 00-04-48551-а Исследование изменения чувствительности растительных клеток к ауксину в онтогенезе (2000-2002) Руководитель – Шишова М.Ф. РФФИ 00-15-99358-м Мембранный механизм действия ауксина (2000-2001) Руководитель – Шишова М.Ф. РФФИ 03-04-48167-а Исследование изменения компетентности растительных клеток к ауксину при переходе от деления к растяжению (2003-2005) Руководитель – Шишова М.Ф. РНП.2.2.2.3. Совместная программа «Михаил Ломоносов II» Министерства образования и науки РФ и DAAD: стажировка в Германии «Роль фосфолипазы А в трансдукции сигналов в растительной клетке» (2006) Руководитель – Шишова М.Ф. Грант Шведского института (Swedish Institute, 2006-2007) № 01716/ 2005. Роль ионов Са2+ в первичной трансдукции внешних и внутренних сигналов в растительных клетках (The role of Ca2+ in the primary transduction of internal and external signals by plant cells). Руководитель- проф. Sylvia Lindberg (Швеция), координатор проекта в России – Шишова М.Ф. РФФИ 07-04-01056-а Изменение значимости протонных насосов различных компартментов растительной клетки в процессе роста растяжением (2007-2009) Руководитель – Шишова М.Ф. РНП.2.2.2.3.16191 Совместная программа «Михаил Ломоносов II» Министерства образования и науки РФ и DAAD: стажировка в Германии «Роль фосфолипазы А в трансдукции ауксинового сигнала» (2008) Руководитель – Шишова М.Ф. РФФИ 10-04-01035-а Сравнительный анализ активности протонных насосов растительной клетки и характера экспрессии генов, их кодирующих, в процессе роста растяжением (2010-2012) Руководитель – Шишова М.Ф. НИР СПбГУ 1.38.67.2011 Выяснение молекулярных механизмов, вовлеченных в реализацию метаболического и гормонального контроля роста и дифференцировки растений (2011-2013). Руководитель – Шишова М.Ф.
Основные публикации: Монографии: Шишова М.Ф., Танкелюн О.В., Емельянов В.В., Полевой В.В. Рецепция и трансдукция сигналов у растений. СПб., изд-во СПбГУ, 2008. 266с. ISBN 978-5-288-04882-1 Юрков А., Шишова М., Семенов Д. Особенности развития люцерны хмелевидной с эндомикоризным грибом. Saarbrücken, LAP Lambert Academic Publishing, 2010. 214с. ISBN 978-3-8433-0360-6 Учебные пособия: Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Лапина Т.В., Шишова М.Ф. Количественный анализ экспрессии генов. СПб., Тесса, 2011. 121с. ISBN 978-5-94086-079-2 Статьи в научных журналах и сборниках: Шишова М.Ф., Опперман К., Пахлер М., Шталь Ф., Шерер Г. Орган-специфичная экспрессия ранних ауксин-зависимых генов проростков арабидопсиса. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 2011. Вып. 3. С. 89-100. Пузанский Р.К., Тараховская Е.Р., Маслов Ю.И., Шишова М.Ф. Влияние экзогенных органических веществ и освещенности на рост микроводорослей. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 2011. Вып. 2. С. 85-99. Рудашевская Е.Л., Яковлев А.Ю., Яковлева О.В., Шишова М.Ф. Цитохимическое выявление активности Н+-АТФазы плазмалеммы и ее изменения у клеток колеоптилей проростков кукурузы разного возраста. // Цитология. 2009. Т. 51, № 2. С. 149-154. Тараховская Е.Р., Маслов Ю.И., Шишова М.Ф. Фитогормоны водорослей. // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 2. С. 186-194. Кирпичникова А.А., Рудашевская Е.Л., Михайлова Ю.В., Шишова М.Ф. Получение везикулярной фракции плазмалеммы из клеток каллусной культуры табака VBI-0 и анализ ее АТФазной активности. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 2005. Вып. 4. С. 62-75. Shishova M., Lindberg S. Auxin perception and plasma membrane Ca2+-channels. // Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems. / eds. M. Kravetch. Kiev, 2004. P. 268-281. Рудашевская Е.Л., Кирпичникова А.А., Шишова М.Ф. Активность Н+-АТФазы везикулярных фракций плазмалеммы, очищенных двумя методами, в присутствии бридж 58. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 2. С. 111-118. Рудашевская Е.Л., Емельянов В.В., Кирпичникова А.А., Бурова Е.А., Бобинова О.А., Шишова М.Ф. Зависимость возрастных изменений ростовой активности колеоптилей и мезокотилей кукурузы от содержания индолил-3-уксусной кислоты. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 3. С. 99-106. Шишова М.Ф., Рудашевская Е.Л., Инге-Вечтомова Н.И., Кирпичникова А.А., Москалева О.В., Выхвалов К.А. Изменение ауксин-индуцированных реакций в зависимости от возраста проростков кукурузы. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 2001. Вып. 1, (№ 3). С. 50-56. Shishova M., Lindberg S. Auxin-Induced cytosolic acidification in wheat leaf protoplasts depends on external concentration of Ca2+. // Journal of Plant Physiology. 1999. V. 46, N 5. P. 190-196. Шишова М.Ф., Линдберг С., Полевой В.В. Активация ауксином транспорта Ca2+ через плазмалемму растительных клеток. // Физиология растений. 1999. Т. 46, №5. С. 718-727. Шишова М.Ф., Рудашевская Е.Л., Инге-Вечтомова Н.И., Глинкина М.В., Кирпичникова А.А., Выхвалов К.А. Свойства катионных каналов плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы, активируемых ауксином. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 1999. Вып. 3. С. 36-43. Шишова М.Ф., Инге-Вечтомова Н.И., Рудашевская Е.Л., Выхвалов К.А. Прямое действие ауксина на транспорт ионов кальция через плазмалемму растительных клеток. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 1998. Вып. 2. С. 89-96. Шишова М.Ф., Инге-Вечтомова Н.И., Выхвалов К.А., Рудашевская Е.Л., Полевой В.В. Ауксин-зависимый транспорт ионов K+ и Ca2+ через мембрану везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы. // Физиология растений. 1998. Т. 45, №1. С. 79-85. Шишова М.Ф., Инге-Вечтомова Н.И., Рудашевская Е.Л., Полевой В.В. Действие ауксина на транспорт катионов через мембрану везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы. // Доклады РАН. 1997. Т. 356, № 5. С. 700-704. Polevoi V.V., Sinyutina N.F., Salamatova T.S., Inge-Vechtomova N.I., Tankelyun O.V., Sharova E.I., Shishova M.F. Mechanism of auxin action: Second messengers. // Plant Hormone Signal Perception and Transduction. / eds. A.R. Smith, A.W. Berry, N.V.J. Harpham et. al. Kluwer Academic Publishers, the Netherlands. 1996. P. 223-231. ISBN 0-7923-3768-9. Шишова М.Ф., Полевой В.В. Влияние импульсного действия ауксина на биоэлектрическую реакцию отрезков колеоптилей кукурузы. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 1993. Вып. 3. С. 83-87. Инге-Вечтомова Н.И., Щипарев С.М., Калинин В.Д., Шишова М.Ф., Выхвалов К.А. Изучение пассивного и активного транспорта ионов через плазмалемму клеток колеоптилей кукурузы с помощью флуоресцентных зондов. // Физиология и биохимия культурных растений. 1993. Т. 25, №2. С. 119-126. Шишова М.Ф., Полевой В.В. Ауксин-зависимая биоэлектрическая реакция и транспорт ИУК в отрезках проростков кукурузы. // Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 1992. Вып. 2. С. 85-91. |
© Биологический факультет СПбГУ, 2006-2011 |