Заведующая лабораторией — Марина Владимировна Падкина, д.б.н., профессор

Тел. (812)327-98-27

Лаборатория биохимической генетики организована на кафедре генетики и селекции в 1975г во главе с к.б.н. М.Н. Смирновым (1939 - 2011). Научные интересы лаборатории биохимической генетики связаны с изучением регуляции метаболизма и экспрессией гетерологичных генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Изучение контроля синтеза кислых фосфатаз

Кислые фосфатазы (кф) являются экзоферментами и секретируются в процессе роста клеток в периплазматическое пространство и на поверхность клеточной оболочки, что позволяет легко определять активность этих ферментов на колониях дрожжей.

Рисунок 1. Дизрупция гена PHO85 приводит к появлению клеток без мтДНК [rho0] у дрожжей S. сerevisiae (окраска DAPI). 1 – 1Г-П4405, 2 – 1-GRF18, 3 – BWG1-7а, 4 – YM954. Стрелками указаны окрашенные ядра.

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae есть три кислых фосфатазы. Синтез кф1 регулируется тиамином, синтез кф2 и кф3 регулируется концентрацией неорганического фосфата. Модель биосинтеза кф позволяет изучать не только влияние отдельных мутаций на структуру и свойства ферментов, но и исследовать генетический контроль регуляции их синтеза.

В последние годы модель регуляции кислых фосфатаз широко используется различными исследователями для изучения структуры и функции хроматина, внутриклеточного сигналинга, посттрансляционной регуляции активности белков, регуляции клеточного цикла, старения, АТФ–зависимого протеолиза белков, вакуолярного транспорта. В лаборатории биохимической генетики изучают механизмы координированной регуляции метаболизма дрожжей в ответ на действие лимитирующих факторов. Мутации в регуляторных генах PHO85, PHO80, PHO4 влияют на катаболизм пролина у дрожжей, на уровень экспрессии гена CIT1, кодирующего первый фермент цикла Кребса, а также регулируют экспрессию гена HSP82, кодирующего шаперон семейства Hsp90p. Hsp90p является важнейшим компонентом специальных буферных систем клетки, которые нивелируют влияние факторов внешней среды, корректируют процессы роста и развития организмов.

Отсутствие протеинкиназы Pho85p у дрожжей приводит к нестабильности наследования митохондриальных нуклеоидов (Рис. 1), а также к нарушению репаративных процессов клетки. Полученные результаты позволили подойти к выяснению механизмов, связывающих физиологическое состояние клетки и стабильность ядерного и митохондриального геномов. Существование таких механизмов хорошо согласуется с физиологической гипотезой мутационного процесса М.Е. Лобашева

Разработка систем для продукции белков млекопитающих в микроорганизмах

Модель кф позволяет развивать не только фундаментальные, но и прикладные исследования. Строгая регуляция транскрипции гена РНО5 и высокий уровень синтеза белка-генного продукта в условиях дерепрессии позволили использовать промотор этого гена для регулируемой экспрессии гетерологичных генов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Дрожжи являются эукариотическими микроорганизмами, поэтому способны обеспечивать корректную модификацию белков человека и животных. У дрожжей подробно изучены механизмы регуляции матричных процессов и метаболизма, при работе с ними используются стандартные методы генной инженерии, дрожжи легко культивировать на относительно дешевых субстратах. Длительный опыт использования дрожжей в хлебопекарной промышленности, пивоварении, виноделии доказал их непатогенность для человека, а также способствовал развитию технологий масштабного культивирования дрожжей. Использование относительно простых питательных сред и возможность выращивания штаммов-продуцентов в строго заданных условиях позволяют выполнять требования GMP (Good Manufacturing Practice) и GLP (Good Laboratory Practice) при производстве гетерологичных белков.

В лаборатории биохимической генетики под контролем промотора гена РНО5 клонированы гены многих белков: α16-интерферона (Рис. 2), β-интерферона и интерлейкина-2 человека, γ-интерферона быка. Все эти белки могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов. Наиболее удачным проектом оказалось клонирование гена IL2 человека. Интерлейкин-2 человека, полученный из клеток дрожжей S. cerevisiae, зарегистрирован Фармкомитетом России под названием Ронколейкин.

Рисунок 2. Электрофореграмма и иммуноблот (б, в) белков культуральной жидкости штамма дрожжей P. pastoris - продуцента химерного белка «альбумин человека и α16-интерферон человека». а: 1 – маркеры молекулярной массы; 3 – α16-интерферон человека; 4 – химерный белок; 6 – альбумин человека; б: 2 – α16-интерферон человека; 3 – химерный белок (антитела к α-интерферону человека); в: 1 – химерный белок; 2 – альбумин (антителами к альбумину человека). Стрелками указано положение химерного белка.

В последние годы в биотехнологии особенно популярны метилотрофные дрожжи P. pastoris. Они накапливают большую биомассу при культивировании на недорогих минеральных средах и обеспечивают высокий уровень синтеза гетерологичных белков. Интеграция интересующего гена в хромосомную ДНК дрожжей гарантирует стабильность полученных штаммов – продуцентов и отсутствие в их геноме бактериальной ДНК, что исключает возможность горизонтального переноса генов устойчивости к антибиотикам, и обеспечивает экологическую безопасность использования штаммов дрожжей - продуцентов рекомбинантных белков.

Значительная часть гетерологичных генов клонирована под контролем промотора гена АОХ1, кодирующего первый фермент утилизации метанола.

Ранее было известно, что экспрессия этого гена зависит только от источника углерода. Мы показали, что на его активность влияют также источники азота: на средах с сульфатом аммония и глутамином экспрессия гена АОХ1 максимальна.

В лаборатории биохимической генетики впервые получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие и секретирующие α16, β и γ-интерфероны человека, интерлейкин-2 человека, γ-интерфероны быка и курицы. Доклинические испытания α16 и β-интерферонов показали, что применение этих препаратов не сопровождается побочными эффектами, наблюдаемыми при использовании интерферонов человека бактериального происхождения, что подтверждает преимущества дрожжей как продуцентов белков человека медицинского назначения.

Для увеличения стабильности рекомбинантных белков используют модификацию их молекулы за счет слияния с молекулой альбумина плазмы крови человека. Альбумин является основным белком плазмы крови человека. Период полужизни альбумина около 19 дней. Альбумин играет роль естественного стабилизатора и переносчика белков плазмы крови и широко используется в качестве стабилизирующего агента при изготовлении лекарственных препаратов, созданных на основе белков.
В лаборатории биохимической генетики впервые получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие и секретирующие химерные белки, состоящиие из альбумина человека и целевого белка (α16-интерферона, β-интерферона и интерлейкина-2 человека). Показано, что химерные белки обладают биологической активностью, свойственной целевым белкам и значительно более стабильны.Межлабораторное сотрудничество

•    Лаборатория генной и клеточной инженерии растений СПбГУ
•    Лаборатория физиологической генетики СПбГУ

Избранные публикации

Цыганков М.А., Зобнина А.Е., Падкина М.В. Синтез модифицированных, устойчивых к протеолитической деградации интерферонов-гамма в дрожжах Pichia pastoris. Прикладная биохимия и микробиология. 2014. Т. 50. № 4. С.429-436.

Rumjantsev A.M., Bondareva O.V., Padkina M.V., Sambuk E.V. Effect of Nitrogen Source and Inorganic Phosphate Concentration on Methanol Utilization and PEX Genes Expression in Pichia pastoris. Scientific World Journal. 2014. V. 2014:743615.

Самбук Е.В., Падкина М.В. Дивергенция экспрессии паралогов PHO3, PHO5, РНО11, РНО12 дрожжей Saccharomyces cerevisiae - механизм эволюции мультигенных семейств. Экологическая генетика. 2013. Т. 11. № 4. С.34-44.

Сазонова Е.А., Зобнина А.Е., Падкина М.В. Влияние дизрупции гена yps1 на жизнеспособность штамма дрожжей Pichia pastoris и на уровень продукции гетерологичных белков. Генетика. 2013. Т. 49. № 6. С. 696-702.

Падкина М.В., Залуцкая Ж.М., Лапина Т.В., Самбук Е.В., Ермилова Е.В. Протеомика микроорганизмов и растений. Принципы, технологии и практическое применение. Изд-во Тесса. 2012. 148 с.

Градобоева А.Е. Дрожжи – продуценты гетерологичных белков. Влияние особенностей метаболизма. LAMBERT Academic Publishing. 2011. 76 с.

Савинов В.А., Физикова А.Ю., Румянцев А.М., Самбук Е.В. Изучение механизмов регуляции гена РНО3 в зависимости от источника азота в среде у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Экологическая генетика. 2011. Т.9. №4. С.70-78.

Физикова А.Ю. Наследование митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Цитология. 2011. Т. 5. № 5. C. 383–391.

Fizikova A. Iu., Sambuk E.V. Regulation of mitochondrial functions according to the environmental changes in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mitochondria: Structure, Functions and Dysfunctions. Nova publishers. 2011. P. 731–768.

Sambuk E.V., Fizikova A. Yu., Savinov V. A., Padkina M. V. Acid Phosphatases of Budding Yeast as a Model of Choice for Transcription Regulation Research. Enzyme Research. 2011. PP.16.

Градобоева А.Е., Падкина М.В. Сигнал ядерной локализации гамма-интерферона быка обеспечивает транслокацию рекомбинантного белка в ядро дрожжей Pichia pastoris. Цитология. 2010. Т. 52. №10. С. 69-74.

Карабельский А.В. Рекомбинантные интерфероны. Продукция и пути усовершенствования. LAMBERT Academic Publishing. 2010. 124 c.

Падкина М.В., Парфенова Л.В., Градобоева А.Е. и др. Синтез гетерологичных интерферонов в клетках дрожжей Pichia pastoris. Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т.46, № 4. С.448-455.